NAD是脱氢酶的辅酶，如乙醇脱氢酶 (ADH)，用于氧化乙醇。它在糖酵解 ，糖异生 ，三羧酸循环 和呼吸链 中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给NAD，使之成为NADH。

而NADH则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透 偶联 的方式，合成ATP。

在吸光方面，NADH在260nm和340nm处各有一吸收峰，而NAD则只有260nm一处吸收峰，这是区别两者的重要属性。这同时也是很多代谢试验中，测量代谢率 的物理依据。NAD在260nm的吸光系数为1780L /(mol·cm)，而NADH在340nm的吸光系数为6200L/(mol·cm)。